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實驗概要

本實驗介紹了唾液淀粉酶的收集與處理方法，淀粉酶的專一性和溫度、pH、激活劑及抑制劑對其酶活性的影響。

實驗原理

酶具有高度專一性，一種酶只能催化一種或一類底物發(fā)生反應(yīng)，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。當(dāng)?shù)矸郾坏矸勖笍氐姿鉃檫€原性麥芽糖和葡萄糖時，能使班氏試劑的Cu² 還原成Cu¹ ，生成磚紅色Cu₂O沉淀。淀粉酶的活性受溫度、pH、激動劑及抑制劑、酶濃度以及作用時間等多種因素影響，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可與碘反應(yīng)生成紫色、棕色或紅色絡(luò)合物。通過上述特征性反應(yīng)，并以蔗糖等作對照，便可觀察、驗證淀粉酶是否具有專一性以及它的催化活性是否受到影響。

主要試劑

1. 1％淀粉稱取淀粉1g，加少量水調(diào)成糊狀，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100ml。

2. 1％蔗糖溶液

3. 班氏試劑 A液：取檸檬酸鈉173ｇ，無水碳酸鈉100ｇ，加水600ml，加熱溶解，冷卻后稀釋至850ml；B液：取結(jié)晶硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）17.3ｇ溶于100ml預(yù)熱的蒸餾水中，冷卻后加水至150ml。將A液緩慢倒入B液中混勻置試劑瓶備用。

4. 碘液：稱取碘4g、碘化鉀6g溶于l000ml蒸餾水中，置棕色瓶內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

5. 各種pH緩沖液

   1) pH6.8緩沖液：取0.2mol/LNa₂HPO₄溶液772ml，0.1mol/L檸檬酸溶液228ml混合即成。

   2) pH4.0緩沖液：取0.2mol/LNa₂HPO₄溶液385.5ml，0.1mol/L檸檬酸溶液614.5ml混合即成。

   3) pH8.0緩沖液：取0.2mol/LNa₂HPO₄溶液972ml，0.1mol/L檸檬酸溶液28ml混合即成。6.0.9％ NaCl 溶液

6. 1％CuSO₄ 溶液

7. 1％Na₂SO₄溶液

主要設(shè)備

1. 滴管、燒杯、試管（架）及試管夾。

2. 恒溫水浴箱與水浴鍋。

3. 脫脂棉、漏斗及紗布。

4. 白瓷反應(yīng)盤。

實驗材料

待測淀粉酶

實驗步驟

1. 唾液淀粉酶的收集與處理

   1) 制備唾液
實驗者先將痰咳盡，用自來水漱口，以清除口腔內(nèi)食物殘渣，再在口腔內(nèi)含蒸餾水約15ml，并作咀嚼咕漱運動，3分鐘后吐入墊有兩層經(jīng)潤濕處理的脫脂紗布的漏斗內(nèi)，過濾于小燒杯中備用，為與下面稀釋唾液相區(qū)別，此稱制備唾液。
   2) 煮沸唾液
取上述唾液約2ml，盛入1中號試管中,置沸水浴煮沸5分鐘備用。
   3) 稀釋唾液
調(diào)整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既無激動劑又無抑制劑條件下，作用5min，水解淀粉至紅色糊精為宜。具體做法是取12凹白瓷反應(yīng)板一塊，按下列步驟操作：
      a. 第1排每凹各加1滴制備唾液，1₂、1₃、1₄凹分別加生理鹽水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到濃（1₄→1₂）小心混勻各凹，勿使濺入相鄰凹中。每混勻一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀釋唾液應(yīng)全部放回原凹中。
      b. 在盛有不同稀釋度唾液的第2排各凹中，均加入4滴緩沖液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸餾水，用a混勻法充分混勻，置37℃下5min。
      c. 在第2排各凹中加I液一滴，混勻，觀察比較各凹顏色，以淺棕-紅色對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，用生理鹽水稀釋3ml制備唾液備用。

2. 唾液淀粉酶的專一性以及溫度、pH、激活劑和抑制劑對唾液淀粉酶活性影響的觀察

   1) 取試管3支編號，按下表1操作

表1 唾液淀粉酶專一性的實驗觀察

將上述各管混勻后，置37℃水浴中保溫10分鐘，然后每管加入班氏試劑20滴，再放入沸水浴中煮沸約15分鐘，觀察各管顏色反應(yīng)，并說明原因。

   2) 溫度影響酶促反應(yīng)的實驗觀察

     a. 取試管3支編號，按下表2操作：

表2 溫度影響酶促反應(yīng)的實驗觀察

      b. 將一、二管移入冰水浴中，待各管溫度一致后速向各管加入碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區(qū)別，并說明溫度對酶促反應(yīng)的影響。

   3) pH影響酶促反應(yīng)的實驗觀察

      a. 取試管3支編號，按下表3操作：

表3 pH影響酶促反應(yīng)的實驗觀察

      b. 將上述各管混勻后，置37℃水浴中保溫10分鐘，然后每管加入碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區(qū)別，并說明pH對酶促反應(yīng)的影響。

   4) 激動劑和抑制劑影響酶活性的實驗觀察

      a. 取試管4支編號，按下操作：

表4 激動劑和抑制劑影響酶活性的實驗觀察

      b. 將上述各管放入37℃水浴中保溫10分鐘，然后每管加入碘液1滴，混勻后觀各管顏色的區(qū)別，并說明激動劑和抑制劑對酶促反應(yīng)的影響。

注意事項

1. 反應(yīng)試管應(yīng)清洗干凈，不同酶液、試劑及其滴管不能交叉混用；

2. 使用混合唾液，或通過預(yù)試選出合適的唾液稀釋度，效果更為顯著。