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淀粉中總糖和還原糖的測(cè)定-3,5二硝基...
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2012-10-01 12:09:31

實(shí)驗(yàn)概要

本實(shí)驗(yàn)利用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定了藕粉和淀粉中的總糖和還原糖。有助于掌握還原糖和總糖的測(cè)定原理,學(xué)習(xí)用比色法測(cè)定還原糖的方法。

實(shí)驗(yàn)原理

在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水楊酸(DNS)與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。

在過(guò)量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色,在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收,在一定的濃度范圍內(nèi),還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系,利用比色法可測(cè)定樣品中的含糖量。

主要試劑

1. 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑:稱(chēng)取6.5g DNS溶于少量熱蒸餾水中,溶解后移入1000mL容量瓶中,加入2mol/L氫氧化鈉溶液325mL,再加入45g丙三醇,搖勻,冷卻后定容至 1000mL。

2. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重的葡萄糖200mg,加少量蒸餾水溶解后,以蒸餾水定容至100mL,即含葡萄糖為2.0mg/mL。

3. 6mol/L HCl:取250mL濃HCl(35%~38%)用蒸餾水稀釋到500mL。

4. 碘-碘化鉀溶液:稱(chēng)取5g碘,10g碘化鉀溶于100mL蒸餾水中。

5. 6mol/L NaOH:稱(chēng)取120g NaOH溶于500mL蒸餾水中。

6. 0.1% 酚酞指示劑。

主要設(shè)備

1. 試管1.5×15cm(×13), 3.0×20cm(×1);

2. 移液管0.2mL(×2),0.5mL(×2),1mL(×5), 10mL(×1);

3. 水浴鍋;

4. 電爐;

5. 分光光度計(jì)。

實(shí)驗(yàn)材料


藕粉,淀粉。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取6支1. 5 cmm×1.5cm試管,按下表加入2.0mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水。

管號(hào)

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)

蒸餾水(mL)

葡萄糖含量(mg/mL)

A540

0

0

1

0

 

1

0.2

0.8

0.4

 

2

0.4

0.6

0.8

 

3

0.6

0.4

1.2

 

4

0.8

0.2

1.6

 

5

1

0

2

 

在上述試管中分別加入DNS試劑2.0mL,于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色,取出后用流動(dòng)水迅速冷卻,各加入蒸餾水9.0mL,搖勻,在 540nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。以葡萄糖含量(mg/mL)為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 樣品中還原糖的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g藕粉,放在100mL燒杯中,先以少量蒸餾水調(diào)成糊狀,然后加入約40mL蒸餾水,混勻,于50℃恒溫水浴中保溫20min,不時(shí)攪拌,使還原糖浸出混。過(guò)濾,將濾液全部收集在50mL的容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,即為還原糖提取液。

3. 樣品總糖的水解及提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g淀粉,放在大試管中,加入6M HCl 10mL,蒸餾水15mL,在沸水浴中加熱0.5h,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全,則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解畢,冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑,以6M NaOH溶液中和至溶液呈微紅色,并定容到100mL,過(guò)濾取濾液10mL于100mL容量瓶中,定容至刻度,混勻,即為稀釋1000倍的總糖水解液,用于總糖測(cè)定。

4. 樣品中含糖量的測(cè)定

取7支15mm×150mm試管,分別按下表加入試劑:

項(xiàng)目

空白

 

還原糖

 

 

總糖

 

0

1

2

3

4

5

6

樣品溶液(mL)

1

1

1

1

1

1

1

3,5-二硝基水楊酸試劑(mL)

2

2

2

2

2

2

2

A540

 

 

 

 

 

 

 

加完試劑后,于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色,取出后用流動(dòng)水迅速冷卻,各加入蒸餾水9.0mL,搖勻,在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。測(cè)定后,取樣品的光吸收平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖含量。

5. 計(jì)算

按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量:

式中:C──還原糖或總糖提取液的濃度,mg/mL;

V──還原糖或總糖提取液的總體積,mL;

m──樣品重量,g;

1000──mg換算成g的系數(shù)。

注意事項(xiàng)

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測(cè)定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行,一起顯色和比色。

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